知母的植物组织培养技术

知母(Anemarrhena asphodeloides Bunge)为百合科知母属，多年生宿根草本植物。知母以干燥根茎入药，属大宗常用商品药材。知母性味苦、甘、寒，归肺、胃、肾经，具有清热泻火，生津润燥的功效[3]，可用于外感热病、高热烦渴、肺热燥咳、骨蒸潮热、内热消渴、肠燥便秘。现代研究表明，知母的化学成分主要为甾体皂苷、双苯吡酮类、木脂素类、多糖类等，能抑制血小板聚集，改善大鼠脑缺血再灌注损伤，同时具有抗炎、抗病毒、抗氧化、利尿、预防肥胖等作用。

本研究在建立知母种子萌发无菌苗的基础上，探讨植物生长调节剂对知母植株增殖及其愈伤组织诱导和再生的影响，为其试管苗的工厂化生产提供理论依据和技术基础。

1 材料和方法

1.1材 料

知母种子由天津农学院园艺园林学院园林植物实验室提供。

1.2 方 法

1.2.1 知母无菌苗的制备 取知母饱满、无病虫害的种子，用70%乙醇进行表面浸种30 s，再用40%的安替福民进行表面消毒20 min。消毒完成后将种子用无菌水反复冲洗3次，每次15 min。将无菌水洗净的种子接种到1/2MS培养基上，在温度25 ℃，光照强度为2 000 lx，12 h光周期条件下进行培养。待种子发芽后长到5 cm高时取出备用。

1.2.2 知母的增殖培养 取长好的知母无菌苗，在**净台中将知母的根去除，并剪去较长的叶片，将处理好的无菌苗接种到诱导知母增殖的培养基上见表1。将接种好的材料放在25 ℃，光照强度为2 000 lx，24 h光周期条件下进行培养。培养大约30 d后，统计每处理的增殖系数和生长情况，增殖苗的生长情况主要指再生苗的长势，分为三级，其中一级为生长健壮;二级为生长速度一般;三级为生长缓慢，细弱[6]。增殖系数=增殖产生的芽数/接种外植体数。

1.2.3 知母再生苗的伸长培养 将增殖培养出的知母小苗从外植体上切下，在**净台中将这些小苗转接到含有不同激素的伸长培养基上进行培养见表2。培养条件同增殖培养，30 d后对知母小苗伸长培养情况进行统计。伸长苗的生长情况主要指苗的长势，分为三级，其中一级为生长健壮;二级为生长速度一般;三级为生长缓慢，细弱。

1.2.4 知母的生根培养 待伸长培养的知母幼苗长到3～5 cm时，在**净台中将其转移到含有不同生长素的生根培养基上见表3。生根培养条件同前面伸长培养，30 d后调查知母根数和生根质量。生根质量：质量好的指所诱导出的根适于移栽成活，一般粗细适中，长度较长，生长势强;相比为一般;最后为差。

2 结果与分析

2.1 知母增殖培养结果

知母植株外植体接种到增殖培养基上，经过一段时间的培养，知母增殖出的小苗从其母株鳞茎处长出。经过大约30 d的培养，对增殖结果进行统计，具体情况见表1。

从表1可以看出，知母在选用不同分裂素时增殖效果不同。其中，BA的效果明显好于KT，不但增殖率明显**KT，而且从增殖苗生长情况来看，在KT培养基上生长出的知母苗普遍表现出生长缓慢、黄化且有玻璃化显现，而在BA上的再生苗生长健壮，同时增殖系数也高。虽然在MS+1.0 mg·L-1BA上增殖系数较高，但从再生苗生长情况来看MS+0.5 mg·L-1BA作为较适的增殖培养基更好。

2.2 知母的伸长培养结果

知母伸长培养试验结果见表2。知母增殖产生的小苗在不加激素的培养基上也能长高，但生长速度较慢，平均高度只有2.1 cm高;当培养基中只加入分裂素，如加入低浓度的BA时伸长效果也不理想，而且再生苗生长细弱，黄化现象严重;只加入生长素时，知母苗很快生根，但苗生长也不很快，分析原因主要由于植株营养一部分转移到根部所致;当在培养基中加入一定量的BA，并配合使用相应浓度的IAA时，知母苗的生长速度明显加快，而且生根现象也受到了抑制。比较表中几种培养基配方，较适合知母伸长生长的为：MS+0.25 mg·L-1BA+0.5 mg·L-1IAA。在此培养基上，知母苗不但生长迅速，同时也很健壮。

2.3 知母再生苗的生根培养

知母生根培养结果见表3。从生根数和平均根长来看，加入IAA的效果要好于加入NAA的效果;从生根质量来看，在NAA培养基上诱导出的根一般都既粗又短，生长缓慢，这类根移栽一般不能成活，而在IAA上生长的根都为正常根，移栽成活率高。因此，在选用生长素进行生根诱导时应选择IAA。比较MS与1/2 MS对生根影响来看，1/2 MS更有利于生根培养，在其培养基上根生长速度较快，根的粗细均匀，分析原因可能是低渗透压利于根的诱导与生长。综合以上两种情况，较适合诱导知母组培苗生根的培养基组合为1/2 MS + 0.5 mg·L-1IAA。

3 讨 论

3.1 组培快繁中一般要经过的培养步骤

一般组培快繁中要经过3个步骤进行。第一步是增殖培养。由于知母通过愈伤组织再生较为困难，本试验选用知母不带根的种子苗作外植体。二是伸长培养。一般新增殖出的幼芽较小，不能直接用于生根培养，要经过一个壮苗的过程，如本试验中知母增殖出的小苗就十分细小，必须要经过进一步培养才能生根。如果在增殖培养基上经过延长培养时间就能获得适合生根的再生苗，也可不进行伸长培养。三是生根培养。生根培养十分重要，因为没有正常生根的组培苗的快繁试验就不能视为成功，因此，不但要诱导出根，还要保证诱导出的根适于移栽，并获得较高的移栽成活率。

3.2 增殖组培中确定培养基组合的原则

在进行组培快繁时，前面的增殖率高并不能说明后面获得的组培苗数量就大，一般越是增殖率较高的处理，其再生芽的长势就越弱，这主要是营养竞争造成的，所以在进行增殖培养时要兼顾增殖率和再生芽的质量。如本试验中笔者选择了增殖系数略低的MS+0.5 mg·L-1BA培养基组合，而舍弃了获得更高的增殖系数的MS+1.0 mg·L-1BA培养基。

3.3 生根培养中渗透压与营养的均衡原则

在进行组培苗的生根培养中，低渗透压培养基有利于生根。但低渗透压是通过降低培养基中无机盐的含量与蔗糖的用量来实现，这会造成植物的营养供应的不足。通常生长健壮的组培苗使用低渗透压培养基可以正常生根，组培苗弱小的必须进行壮苗培养后才可使用。